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研究背景

l爱泼斯坦巴尔病毒（EBV）以无症状的方式持续感染许多成年人，并且与多种癌症相关。当前针对EBV相关肿瘤的治疗非常局限，其具有显著的脱靶毒性以及对复发或难治性疾病的疗效不完全性。通过体外继承式转移产生的EBV特异性细胞毒性T细胞（CTL）来恢复对EBV的免疫力，成功地治疗了一些造血细胞移植患者中的EBV相关肿瘤。但是，这种方法对于实体器官转移患者的EBV相关肿瘤无效，并且还因难以在体外产生足够数量的EBV特异性CTL而受限。

lVδ2-T细胞可以通过非MHC依赖的方式被磷酸抗原（哺乳动物细胞中甲羟戊酸途径的小的非肽磷酸化中间体）活化和扩增。异戊烯基焦磷酸酯（IPP）作为磷酸抗原的一种，可选择性活化和扩增人Vδ2-T细胞。帕米膦酸（PAM）是一种常用于治疗骨质疏松的氨基双膦酸盐药，可诱导IPP在细胞内蓄积，导致人Vδ2-T细胞在体外和体内的活化和扩增。使用免疫缺陷的Rag2-/-γc-/-小鼠和人源化小鼠EBV-LPD模型，显示体外及体内PAM扩增的Vδ2-T细胞可控制EBV-LPD的细胞，这表明基于Vδ2-T细胞的免疫疗法在与EBV相关的肿瘤中具有潜力。但是，由于某些癌症患者的Vδ2-T细胞难以通过磷抗原扩增，并且重复施用磷抗原可能导致Vδ2-T细胞衰竭，因此其临床运用尚有缺陷。

l外泌体在多种研究中证实可被编辑以实现靶向特异性，使其成为纳米载体提供抗肿瘤剂并诱导抗原特异性抗肿瘤免疫力。因此，基于外泌体的疗法对癌症患者具有很好的治疗潜力。并且在临床前模型或临床试验中有包括树突状细胞（DC）外泌体（DCExos）和自然杀伤外泌体（NK-Exos）等多种实例。与基于细胞的疗法相比，外泌体具有类如高产量、高安全性、易保存、低成本等优势。综上，Vδ2-T细胞衍生的外泌体（Vδ2-T-T-Exos）的抗肿瘤活性仍然未知。此研究提出了使用Vδ2-T-Exos治疗EBV相关肿瘤的策略。

研究结果

l使用PAM从健康的人外周血单核细胞（huPBMC）激活并扩增Vδ2-T细胞后在无外泌体的培养基中培养48小时。收集培养基进行差异超速离心。通过纳米颗粒跟踪、电子显微镜对收集物形态学观察及蛋白质印迹分析显示外泌体标记物CD63，TSG，CD81和Alix呈阳性，内质网蛋白GRP94阴性，综合证实外泌体的存在。CD63和TCR-γδ阳性表明这些外泌体起源于Vδ2-T细胞，而CD4，CD8和CD19的缺失排除了其他免疫细胞。Vδ2-T-Exos对凋亡激活受体（FasL和TRAIL），NK细胞激活受体（NKG2D），抗原提呈分子（MHCI和II类）和CD80、CD86的配体呈阳性，表明它们在癌症免疫治疗中具有潜力。

lVδ2-T-Exos用1,1-二十八烷基-3,3,3，3四甲基吲哚碳菁高氯酸盐（Dil）或羧基荧光素的亲脂性染料标记然后将琥珀酰亚胺酯（CFSE）添加到EBV转化的B淋巴母细胞系（EBV-LCL）培养基中。以通过超速差异离心从无外泌体的培养基中分离的Dil或CFSE标记微球作为对照。Rag2-/-γc-/-免疫缺陷小鼠皮下接种含增强表达的绿色荧光蛋白（EGFP）EBV-LCL建立EBV相关肿瘤模型。将DiR标记的Vδ2-T-Exos及对照组腹腔注射到患有EGFP+EBV相关肿瘤的小鼠中。体内成像系统发现Vδ2-T-Exos在肿瘤组织中的积累。流式细胞学分析显示所有EBV-LCL在与CFSE标记的Vδ2-T-Exos孵育后变为CFSE阳性。EBV-LCL对Vδ2-T-Exos的摄取高于自体正常B细胞，表明Vδ2-T-Exos可以特异性地靶向EBV-LCL。由于脂质体与外泌体具有相似的物理特性，它与EBV-LCL或自体正常B细胞一起孵育后，EBV-LCL和自体正常B细胞之间未观察到脂质体摄取效率的实质差异，证实Vδ2-T-Exos靶向EBV-LCL不是由于非特异性相互作用。EBV-LCL对Vδ2-T-Exos的吸收取决于NKG2D在Vδ2-T-Exos上与其配体MHCI类链相关的AB（MICA/B）之间的相互作用。抗NKG2D的单克隆抗体（mAb）阻断Vδ2-T-Exos上的NKG2D抑制EBV-LCL对Vδ2-T-Exos的吸收作用。相反，在Vδ2-T-Exos上阻断TCR-γδ不会抑制EBV-LCL对Vδ2-T-Exos的吸收。说明Vδ2-T-Exos靶向EBV相关的肿瘤细胞不依赖携带的TCR-γδ。

lVδ2-T-Exos以剂量依赖的方式诱导EBV-LCL和SNU-细胞的凋亡，而对自体正常B细胞没有这种作用。凋亡主要由密度分离的含外泌体的组分6、7和8诱导。阻断外泌体的分泌会降低Vδ2-T细胞对EBV-LCL的杀伤活性。暴露于Vδ2-T-Exos的EBV肿瘤细胞展现出活性增强的caspase-3。与自体正常B细胞相比，EBV-LCL具有大量的表面Fas和TRAIL受体2（凋亡诱导受体，DR5）。与EBV-LCL相似，SNU-细胞也具有丰富的Fas和DR5，其中约％的细胞对这些受体呈阳性反应。另外，Vδ2-T-Exos对诱导死亡的配体FasL和TRAIL呈阳性。阻断FasL/Fas或TRAIL/DR5途径可抑制Vδ2-T-Exos诱导的EBV-LCL细胞凋亡，表明V?2-T-Exos诱导的EBV-相关的肿瘤细胞凋亡这些途径有关。

l作者团队对Rag2-/-γc-/-免疫缺陷小鼠建立的EBV淋巴瘤模型施用Vδ2-T-Exos。与PBS对照组相比，接受Vδ2-T-Exos治疗的小鼠肿瘤发生率降低。体内成像和肿瘤体积证明治疗组小鼠中，肿瘤的生长受到抑制并延长了生存期。免疫组化显示，治疗组EBV诱导B细胞淋巴瘤内的Ki67阳性细胞少于对照组。这些数据表明Vδ2-T-Exos控制了小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤的发展。为进一步探索Vδ2-T-Exos是否对EBV淋巴瘤或不同的EBV相关肿瘤皆具有治疗作用，分别对EBV淋巴瘤植入模型鼠和EBVaGC，SNU-细胞植入模型鼠进行Vδ2-T-Exos和PBS分组对照治疗。两种模型观察结果中，Vδ2-T-Exos延长了携带EBVaGC的小鼠的存活时间并抑制了肿瘤的生长。免疫组化显示PBS处理的淋巴瘤小鼠肿瘤组织中有大量Ki67阳性细胞，而Vδ2-T-Exos处理的肿瘤组织中只有少量Ki67阳性细胞。同样的方法下，在人源EBV-LCL的肿瘤模型小鼠中，经Vδ2-T-Exos处理的小鼠的肿瘤发生率低于PBS处理的小鼠，存活率也大大提高，免疫组化结果也与在Rag2-/-γc-/-免疫缺陷小鼠的实验结果一致。

此外，相比自体Vδ2-T-Exos，同种异体Vδ2-T-Exos在控制人源化小鼠中EBV诱导的B细胞淋巴瘤的发生率和肿瘤生长及存活率上更有效。同种异体V?2-T-Exos处理的人源化小鼠中，肿瘤细胞的增殖能力比自体Vδ2-T-Exos处理的小鼠低。免疫荧光分析显示同种异体Vδ2-T-Exos治疗小鼠里浸润到肿瘤组织中的CD3T细胞比自体Vδ2-T-Exos或PBS治疗的肿瘤中的多，提示同种异体Vδ2-T-Exos可增强宿主T细胞介导的抗肿瘤反应。比较同种异体Vδ2-T-Exos对人源化小鼠和Rag2-/-γc-/-小鼠之间EBV诱导的B细胞淋巴瘤的治疗效果后，人源化小鼠中用同种异体Vδ2-TExos进行治疗更为有效。总结来说，Vδ2-T-Exos可控制Rag2-/-γc-/-和人源化小鼠中EBV肿瘤的发生发展，并且同种异体外泌体在人源化小鼠中有更好疗效。

l同种异体Vδ2-T-Exos增加了趋化因子受体5（CCR5）阳性的CD4和CD8T细胞的比例。将T细胞与同种异体Vδ2-T-Exos一起培养会增加T细胞向EBV-LCL的迁移，并且这种迁移受到CCR5阻断抗体的抑制。这些结果表明同种异体Vδ2-T-Exos通过增加T细胞上CCR5的量来增加T细胞向EBV相关肿瘤组织的浸润。同种异体Vδ2-T-Exos刺激CD4和CD8T细胞增殖的程度更大并促进产生IFN-γ。分别阻断MHCII类参与或CD86激活的共刺激受体与抗MHC-II或CD86的中和抗体的结合，可抑制上述结果。而抗体阻断MHC-1或CD86不会影响CD8T细胞中这些诱导的反应。同种异体Vδ2T-Exos促进了EBNA1特异性CD4和LMP2a特异性CD8T细胞克隆的扩增，表明Vδ2-T-Exos可以促进先前存在的肿瘤特异性抗原T细胞的扩增，增强其控制EBV相关肿瘤的能力。之后作者在人源化小鼠中实验发现缺乏CD4或CD8T细胞的小鼠肿瘤体积变大，存活率降低，这些结果表明Vδ2-T-Exos的抗肿瘤作用主要通过刺激CD4和CD8T细胞介导的抗肿瘤免疫能力来发挥。

l作者比较Vδ2-T-Exos与其他免疫细胞衍生的外泌体（如DC-Exos、NK-Exos），DC-Exos带有免疫刺激分子MHC-II，CD80和CD86，但对凋亡受体配体的阳性率较低；NK-Exos带有凋亡受体配体FasL和TRAIL，但对免疫刺激分子的阳性率较低。与之相比，Vδ2-T-Exos同时携带免疫刺激分子和死亡受体配体，因此它同时具有细胞毒性和T细胞刺激性抗肿瘤作用。进一步实验中，用Vδ2-T-Exos和NK-Exos分别处理人源化小鼠EBV肿瘤模型。结果显示Vδ2-T-Exos的治疗效果优于PBS和NK-Exos。Vδ2-T-Exos在控制EBV相关肿瘤方面比DC-Exos和NK-Exos更有效。

研究意义

此研究设计严谨完善，思路清晰，从机制到治疗目标，十分完整的阐述了Vδ2-T-Exos的作用机理和效果，为使用Vδ2-T-Exos治疗EBV相关肿瘤策略提供了有力的临床概念和思路。作为一种无细胞疗法，Vδ2-T-Exos继承了Vδ2-T细胞的细胞毒性和免疫刺激特性，具有综合NK-Exos和DC-Exos的优势，使这些外泌体能够有效控制EBV相关肿瘤。因此，基于Vδ2-T-Exos的疗法，尤其是基于同种异体Vδ2-T-Exos的疗法，具有巨大的潜力，可以克服传统的针对EBV相关肿瘤的免疫疗法的缺陷和不足。

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