CancerCell亚洲肝细胞癌和肝内

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原发性肝癌包含两种在组织学上截然不同的亚型，即肝细胞癌（HCC）和肝内胆管癌（ICC），且由于其具有的基因学和生物学异质性，使得它们成为世界上第二大致命的恶性肿瘤。本期iProteome为大家带来的便是一项关于HCC和ICC分子亚型的工作，文章发表在17年的CancerCell上。

Highlights

ICC和HCC由几种稳定的分子亚型组成

ICC和HCC有共同的分子亚型和驱动基因

亚洲特异性ICC和HCC亚型与独特代谢进程相关

致癌的PLK1和ECT2是与亚型相关的生物标志物

Introduction

HCC和ICC的诊断一般都是基于放射学、血清学和/或病理评估。近年来，根据HCC分期指南，分子靶向治疗被广泛应用，以求达到最佳的治疗效果。但是，近期对于III期患者治疗的失败，证明此类疗法的疗效有限。

虽然ICC在形态上和HCC存在明显的区别，但是由于其复杂的组织学和生物学特性，对于两者的分类一直存在争论。现有分类模型并不是根据独特的肿瘤生物学特性对肿瘤进行区分的，而这种特性是进行有效治疗的必要条件，因此传统的分类模式必然带来一定的缺陷。

有关HCC和ICC的多因素病因，主要包括环境因素，例如乙型肝炎病毒（HBV），丙型肝炎病毒（HCV），寄生虫感染和化学致癌物的影响。其他风险因素主要是指不健康的生活习惯，例如吸烟、过度饮酒及饮食因素。而且，除了性别和种族/民族差异性外，肝癌主要影响男性，且在亚洲人口中尤其普遍。在上述众多致病因素中，HBV和HCV是HCC的主要致病因素，且全球超过90%的肝癌均属于HCC；相比之下ICC并不常见，除了在东南亚地区，比如泰国东北部，因为那里有因肝吸虫而感染的地方性疾病。

上述HCC和ICC所具有的全球性的差异，产生原因可能是不同种族之间存在不同致病因素，而不同的致病因素可以触发不同的分子机制，并独立地启动恶性转化，从而导致患者之间产生巨大的基因组异质性。这种独特的致病因素模式为研究癌症异质性和相关的独特肿瘤生物学提供了机会。

本研究通过对基因组、转录组和代谢组的系统整合，试图证明亚洲HCC和ICC患者共有的、具有相同关键驱动基因的分子亚型。同时，期望能够根据不同分子亚型的生物标志物，寻找新的药物靶点，提高肝癌诊断和治疗的精准性。

Results

由转录组和共识聚类确定肿瘤分子亚型

为了提高对肝癌的理解，作者建立了一个综合性的生物储存库——泰国肝癌基因组学和表达研究（TIGER-LC）联盟，存储了大量与泰国肝癌患者相关的生物标本。而且，转录组学、基因组学、体细胞拷贝数改变（SCNA）和生物样本代谢组学特征的系统整合，为更好地分类癌症中的分子亚型和相关驱动因素提供了一种综合方法。

本研究利用上述资源及方法，确定了例泰国患者的分子亚型，且分型结果在来自亚洲、欧洲和北美洲的例肝癌患者中得到进一步验证。

分型过程主要是：首先，对例患者的配对肿瘤和非肿瘤标本进行人类转录组数据筛选。其中例肿瘤样本和例非肿瘤样本通过质控检验，用于转录组分析；而后，对所有原发性肝脏肿瘤进行无监督层次聚类和主成分分析，使用肿瘤标本间的差异基因来确定转录组模式。结果显示，这些原发性肝脏肿瘤的确具有一些不同的转录组模式；但是，部分样本显示出一种重叠模式，表明部分ICC和HCC具有相似的分子特征（图1A和1B）。然后，为了比较这些分子特征，作者通过共识聚类（cCluster）的方法在ICC和HCC中确定出不同亚型——HCC的三种主要亚型和ICC的四种主要亚型，且这种分类模式显示出独立于已知的诊断因素、肝硬化、分期或病因学的特性。

为了比较ICC和HCC的亚型，作者使用了一种无监督的子类映射方法（SubMap）对每个预测的ICC和HCC亚型之间的分子特征进行成对比较，如图1C和1D所示，并输出两个子类共享相同或相似的基础转录组模式的统计学可能性（Bonferroni校正的P值0.05表示结果显著）。

图1ICC和HCC分子亚型的鉴定

本研究显示，ICC-C1和HCC-C1亚型的分子特征显著相似（P=0.01），ICC-C2和HCC-C2/C3亚型也是如此（P=0.01）（图2A）。但是，在非肿瘤组织中未观察到这种关系，提示亚型相关基因具有肿瘤特异性。此外，对ICC和HCC中共同亚型C1和C2的无监督层次聚类，揭示了原发性肝脏肿瘤中每种亚型的分子模式具有惊人的相似性，而与已知的诊断因素、肝硬化、分期或病因无关（图2B）。然后，GSEA显示，ICC-C1和HCC-C1亚型均富集有丝分裂检查点信号通路，表明该亚型具有较高的染色体不稳定性；ICC-C2和HCC-C2亚型富集细胞免疫相关通路，暗示炎症反应与C2亚型相关（图2C）。有趣的是，被诊断为HCC-C1亚型的患者生存差，HCC-C2亚型患者生存较好；而且，在ICC-C1和ICC-C2患者中观察到相似的趋势（图2D）。

这些结果表明，尽管ICC和HCC之间具有明显的组织学差异，但是在这些具有相似转录组模式、肿瘤生物学和预后的原发性肝癌中，相同的亚型是显著的。

图2ICC和HCC共同分子亚型C1和C2的鉴定

种族/民族相关的共同肿瘤亚型

为了进一步确定ICC和HCC的共同分子亚型的普遍性，本研究检查了几个来自亚洲、欧洲和北美洲患者的转录组数据的独立队列。SubMap用于确定转录组识别的不同亚型之间的相似性。

研究发现，在中国HCC患者、亚裔美国HCC患者（n=）、日本ICC患者和高加索ICC患者中均发现C2分子亚型，但是未在欧洲裔美国HCC患者中发现（图3A-3E）。相比之下，研究发现，在所有的ICC和HCC患者中均发现了一种分子相似的C1亚型，此结果不受其种族/民族和组织学类型的影响。有趣的是，泰国ICC、泰国HCC、中国HCC和日本ICC的C2亚型的预后结果要优于高加索ICC的C2亚型，而亚洲队列中的C1亚型预后结果较差。

为了进一步研究HCC和ICC可能重叠的分子/预后亚型之间的关系，作者通过无监督的层次聚类方法，比较了几个亚洲队列中HCC或ICC的C1和C2亚型。该分析揭示了两个聚类，其中亚洲ICC和HCC的C1亚型和C2亚型分别聚集在一起，并且两者之间存在明显界限；且在每个聚类中，C1和C2的富集具有统计学意义；相比之下，在每个聚类中，未观察到HCC和ICC富集的统计学差异（P=0.）。因此，这些数据证实并显示了C1和C2亚型的独特转录组谱，以及它们在ICC和HCC中是共同存在的。

此外，本研究针对亚洲和高加索ICC和HCC患者的C1分子亚型进行了生存分析。结果显示，虽然两者具有相似的肿瘤转录组模式，但是生存结果显著不同，亚洲患者的生存率要显著低于高加索患者（图3F）。在基于生存数据的森林图中，将TCGA的高加索HCCC1患者与任何亚洲ICC或HCCC1患者进行比较时，观察到统计学上的风险比增加（P0.05）（图3F），进一步说明了亚洲队列中C1亚型预后结果较差。

综上所述，这些结果表明ICC和HCC的共同分子亚型也与种族/民族有关。

图3中国、日本和美国的亚洲人中的HCC和ICC肿瘤亚型

亚型相关的癌症驱动基因

为了明确亚型相关的驱动基因，作者对泰国ICC和HCC进行了靶向外显子组测序。在对肿瘤和成对的非肿瘤组织中捕获了个蛋白质编码基因的外显子和周围非编码基因组区域，这些基因最常重复出现并在COSMIC数据库定义的不同实体瘤类型中发生突变。

结果发现，ICC和HCC的突变类型相似（图4A）；ICC的平均突变率是每兆碱基4.4个突变，HCC的平均突变率是每兆碱基3.7个突变，两种肿瘤类型之间无显著差异（图4B）。值得注意的是，ICC具有更多的CT转换突变，而HCC具有更多的AC，AT和CA转换突变（图4C-4F）。

图4泰国ICC和HCC的突变谱及其功能结果

在22个ICC候选驱动基因和32个HCC候选驱动基因中，8个基因(TP53、ARID1A、ARID2、CSMD3、RYR2、NF1、PRKDC、PSIP1)在两者中均较为常见（图5）。与日本ICC、COSMICICC或COSMICHCC患者相比，泰国ICC或HCC患者中候选驱动基因的比较显示出一致的突变频率（表S7）。与其他已发表的研究一致，作者观察到ICC和HCC具有复杂的突变景观，肿瘤间存在巨大的异质性，但没有明显的显性驱动基因，因为大多数基因在这些肿瘤类型中突变的频率较低（图5）。还需要注意的是，RYR2、CSMD3、SYNE1等基因虽然突变重复率相对较高，但已不再被认为是癌症基因。

图5泰国ICC和HCC的驱动基因图谱

由于有例日本ICC肿瘤的基因突变数据，作者确定了本研究中发现的共同亚型与中村等人()描述的前32个突变基因之间是否存在任何关系。

研究发现，虽然突变数据并不能清楚地区分共同亚型，而且每种亚型的突变频率为1%至43%不等；但TP53，KRAS，MYC和GNAS中的突变（10％突变）显示C1亚型中的富集，并伴随不良预后（图6A和6B）；BAP1和IDH1突变在UM中更为频繁，该亚型与C1/C2亚型不匹配，但预后良好。值得注意的是，15%的UM亚型中存在IDH1突变，但是C1和C2亚型中不存在此突变，说明ICC的这种独特的亚型具有明显的基因突变模式及较好的预后。有趣的是，作者发现基于SCAN和转录组，在统计学上有显著数量的基因（51个驱动基因中的3个，即NRAS、PRKCI和ECT2）与这32个突变基因重叠（P=0.）（图6C）。值得注意的是，突变频率在不同的队列之间是不同的。这些异质性可能与人群的差异有关，也可能与潜在病因不同的ICC和HCC的临床肿瘤异质性有关。然而，未观察到主要病因与突变谱之间的明确关系。

作者进一步分析了外显子组测序项目发现的ICC中突变频率较高的三种基因（IDH1、IDH2和BAP1），发现这三种基因的突变在不同队列中差异很大。事实上，数据表明，与亚洲或非洲血统ICC患者相比，欧洲血统ICC患者中BAP1突变出现的频率更高，而IDH1和IDH2突变总是单独出现。一直以来，作者仅发现1例IDH1突变的泰国ICC病例。相反，在泰国队列中，C1亚型比C2亚型含有更多的P53突变（图5）。

作者还发现，p53RS突变是一种黄曲霉毒素特征性突变，仅与HCC-C3亚型相关（数据未显示），这表明一种与该亚型相关的独特环境暴露条件。

因此，基于癌变量设计的靶向外显子组测序可以识别相对高频率的驱动突变，类似于全外显子组测序。

随后，作者在泰国肿瘤样本和配对的非肿瘤组织中确定了SCNA。结果发现ICC和HCC之间的SCAN分布差异很大。然而，当分析基于C1和C2亚型的SCAN时，发现与ICC-C2和HCC-C2相比，ICC-C1和HCC-C1的拷贝数获得或丢失的水平显著更高。这一结果与转录组和GSEA分析一致，提示ICC-C1和HCC-C1存在有丝分裂检查点缺陷，可能导致非整倍体程度较高。

为了进一步确定潜在的亚型相关驱动基因，基于驱动基因在SCAN和基因表达之间应该具有高度的一致性改变的观点，作者首先进行了SCAN和转录组之间的Pearson相关性分析。

分析结果显示，有一部分基因存在显著的正相关关系，其中个基因属于ICC-C1肿瘤样本，89个基因属于HCC-C1肿瘤样本。其中，ICC-C1和HCC-C1有51个基因重叠（图6C），提示在ICC和HCC中存在共同的亚型特异性驱动基因。与先前结果一致，C1亚型比C2亚型具有更多的拷贝数增加和更高的表达水平（图6D）；此外，对这51个基因的网络分析显示，PLK1信号与有丝分裂检查点信号通路的富集相关（图6E）。此外，ECT2是C1和C2亚型中排名最高的差异表达基因。与泰国ICC和HCC一致，作者在美国的HCC患者中还观察到51种常见的亚型相关基因与种族/民族相关的预后之间的关联。值得注意的是，6%的日本ICC-C1亚型也出现ECT2突变，这与先前发现ECT2是共同C1亚型的功能驱动基因的结果相一致（图6）。

上述数据表明，ECT2和PLK1可能是用于检测ICC和HCC亚型的临床相关功能性生物标志物，因为两者之前都与肿瘤进展相关。

随后，作者进一步通过对例泰国患者构建的ICC和HCC组织微阵列（TMAs）的免疫组织化学（IHC）评估了ECT2和PLK1。结果发现PLK1在细胞质中被检测到，但是它在正常肝细胞中不表达；ECT2在细胞核中被检测到，但在正常肝细胞中不表达。通过IHC检测到的这些蛋白质的表达水平与mRNA数据相关，进一步分析发现PLK1和ECT2的表达在RNA水平和蛋白表达水平上存在相关性。而后，对PLK1和ECT2分别进行了生存分析（图S3N），表明TMA得分较高的PLK1或ECT2患者的预后不良。鉴于PLK1和ECT2之间的表达具有显著的相关性，并且事实证明PLK1在体外可磷酸化ECT2，因此作者评估了两种生物标记物的组合来预测结果。基于先前相关生物标志物比例组合的例子，作者从TMA评分中生成了PLK1/ECT2比值，并进行了生存分析(图6G)，结果表明PLK1/ECT2比值对于区分结果是稳健的。为了确定PLK1和ECT2表达的组合是否是结果的通用预测指标，作者基于不同队列中两个基因的中值表达，评估了高/低mRNA联合组。作者发现，在亚洲的HCC患者中，PLK1和ECT2联合高表达与PLK1和ECT2联合低表达相比，患者生存率较差(图S3O)；然而，在高加索患者中没有观察到与预后的关系。在亚洲ICC和高加索ICC患者中观察到类似的趋势(图S3P)。这些数据表明，与基于mRNA的水平相比，PLK1和ECT2蛋白水平可能更能反映患者的预后，更适合用于诊断。

图6整合体细胞拷贝数改变和基因表达，以定义ICC和HCCC1、C2亚型中与亚型相关的驱动基因

肥胖与肿瘤亚型

为了确定病因学/人口统计学/临床特征是否与确定的肿瘤亚型相关，作者根据现有的临床变量(包括年龄、性别、烟酒消费、BMI和肿瘤特征)比较了C1和C2亚型。在泰国ICC和HCC中，只有年龄、BMI状况和肿瘤大小在C1和C2亚型中存在差异。应该注意的是，ICC和HCC之间的饮酒、HBV和HCV状况、肝硬化、碱性磷酸酶、CA19-9、α-甲胎蛋白的水平以及肿瘤分期有显著差异。有趣的是，这些病因与共同的分子亚型无关，但与组织学亚型有关。

由于在泰国的C2患者中发现的BMI高于C1，因此作者利用现有的BMI数据进一步确定了泰国、AsA和EA患者的BMI状况。作者发现EA病人比亚洲病人有更高的BMI，无论他们生活在美国或亚洲。C2亚型BMI往往高于C1亚型，差异有统计学意义。

由于BMI是衡量肥胖的指标，肥胖是一种与新陈代谢变化有关的疾病。因此，作者通过对来自泰国的名ICC和HCC肿瘤组织标本进行了非靶向的代谢组学分析，确定了代谢变化是否与HCC和ICC中鉴定的预后亚型相关。由于整合代谢物和基因表达谱是减少假阳性和增加定义功能性代谢物机会的有效方法，因此作者在代谢物和基因表达谱之间进行了Pearson相关分析（图S4C和S4D）。在个最易变代谢物中，77个代谢物为ICC代谢物，81个代谢物为HCC代谢物，其与基因表达高度相关。研究还发现ICC和HCC之间有大量的重叠代谢物(n=46)。而且，与基因表达高度一致的代谢物能够区分C1和C2亚型（图7A）；ICC和HCC中最重要的代谢物的上层网络惊人地相似（图7B）。此外，在ICC-C2和HCC-C2中，胆汁酸相关代谢物，如牛磺酸脱氧胆酸和牛磺酸脱氧胆酸(TUDCA)的含量明显高于C1亚型（图7C）。

C2亚型与BMI升高有关，而BMI升高与代谢性疾病和细胞炎症有关。此外，已知C2亚型相关的胆汁酸代谢产物与炎症和免疫有关。事实上，C2亚型的基因表达谱也与免疫和炎症途径有关。因此，作者使用CIBERSORT检测了泰国ICC和HCC中浸润的免疫细胞。结果发现C2亚型的白细胞浸润活性远高于C1亚型（图7D）。值得注意的是，CD4+记忆性T细胞和γδT细胞升高，T调节细胞降低均与C2亚型相关（图7E）。

综上所述，C1亚型存在PLK1和ECT2改变的有丝分裂检查点缺陷，而C2亚型存在BMI升高、免疫细胞异常和胆汁酸代谢异常。

图7肝癌C1和C2亚型的胆汁酸代谢和炎症发生改变

Disscussion

在当前的研究中，作者建议整合组学方法，将基因组学、表观基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学数据有机地联系起来，是解决肿瘤异质性和识别癌症驱动基因的关键。

具体而言，本研究表明，C1亚型与有丝分裂检查点缺陷和P53突变有关，而PLK1和ECT2是两个关键的临床相关基因；进一步分析显示，PLK1和ECT2的表达可以作为亚洲ICC和HCCC1亚型患者分类和分子靶点的生物标志物。

此外，代谢性肝病和肥胖与肝脏炎症和癌症有关。作者发现与C2亚型相关的一个常见临床特征是BMI升高，提示可能与肝脏相关的代谢性疾病有关；而且，进一步研究发现C2亚型的细胞免疫相关通路富集，再次证实了炎症反应与C2亚型相关的观点。

虽然作者的结果显示共同的C1-C2亚型主要与亚洲患者相关，但这种种族/民族相关的原因尚不清楚。

总之，本研究的整合组学方法已经定义了几个亚洲人群中ICC和HCC的共同分子亚型，并确定了与这些特定亚型相关联的潜在驱动基因和代谢过程。TIGER-LC联盟正在进行进一步的努力，以更全面地了解ICC和HCC的生物学特性，并改善肝癌患者的预后。

作者：裴晓如

原文引用：doi:10./j.ccell..05.

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